蛋白发光染液的工作原理

化学发光染液工作原理：以常用于免疫印迹（Western Blot）实验的增强化学发光（ECL）染液为例，其核心反应体系围绕辣根过氧化物酶（HRP）和鲁米诺构建。在检测过程中，首先 HRP 标记的抗体与膜上的目标蛋白特异性结合，形成抗原 - 抗体 - HRP 复合物。随后加入含有鲁米诺和过氧化氢的 ECL 工作液，在 HRP 的催化作用下，过氧化氢分解产生氧自由基。氧自由基具有强氧化性，会将鲁米诺氧化为激发态的 3 - 氨基邻二甲酸。处于激发态的 3 - 氨基邻二甲酸不稳定，当它回到基态时，会以光的形式释放多余能量，从而产生化学发光信号。该信号的强度与目标蛋白的含量相关，通过检测发光信号的强度和位置，即可确定目标蛋白的存在和含量。为了进一步提高检测灵敏度，一些 ECL 发光染液中还添加了特殊的增强剂，这些增强剂能够与反应中间产物结合，稳定激发态分子，减少能量损失，显著增强发光信号并延长发光时间，使检测灵敏度可达到飞克（fg，10?1?g）级别，能够检测到极低含量的目标蛋白 。

荧光发光染液工作原理：荧光蛋白发光染液利用了荧光染料与蛋白质结合后在特定波长光激发下发出荧光的特性。以 DyLight 系列荧光染料为例，这类染料具有良好的水溶性、pH 不敏感性、高亮度、光稳定性以及较长的图像采集时间等优点。其与蛋白质的结合主要通过与蛋白质的氨基或巯基等活性基团发生共价结合，从而实现对蛋白质的标记。当被标记的蛋白质受到合适的激发光照射时，荧光染料分子吸收光子能量，电子从基态跃迁到激发态。由于激发态不稳定，电子会迅速从激发态回到基态，在此过程中以光的形式释放能量，发出特定波长的荧光?？蒲腥嗽蓖ü獬上裆璞讣觳庥庑藕诺那慷群头植?，从而对蛋白质进行定性和定量分析。不同的荧光染料具有不同的激发和发射光谱，这使得科研人员可以根据实验需求选择合适的荧光染料，实现对多种蛋白质的同时检测。例如在多重免疫荧光实验中，使用不同激发和发射光谱的荧光染料标记不同的抗体，一次实验即可检测多个目标蛋白，通过不同颜色的荧光信号直观展示各蛋白质在细胞或组织中的定位和表达情况 。