337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 用户指南

337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 用户指南

——高效、灵敏的实时荧光定量PCR（qPCR）解决方案

一、产品概述

337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 是德国凯杰（QIAGEN）公司推出的高灵敏度实时荧光定量PCR预混液，专为基于SYBR Green染料的qPCR实验设计。该产品包含优化配方的反应缓冲液、高保真HotStart DNA聚合酶、dNTPs及SYBR Green I染料，适用于基因表达分析、SNP分型、病原体检测等应用场景。

核心参数：

• 货号：337839

• 规格：25 mL（可满足250次20 μL反应）

• 保存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融

• 有效期：24个月（未开封）

• 适用仪器：兼容Bio-Rad、Applied Biosystems、Eppendorf等主流qPCR仪

二、技术优势

1. 高灵敏度与特异性

• HotStart技术：化学修饰的DNA聚合酶在95℃高温下激活，有效抑制非特异性扩增，减少引物二聚体形成。

• SYBR Green I优化：染料与双链DNA结合效率高，荧光信号强，适用于低丰度模板的检测（可检测至单拷贝基因）。

2. 宽动态范围与高重复性

• 线性范围：覆盖7个数量级（101–10?拷贝），适用于绝对定量与相对定量分析。

• 批间差异：CV值<5%（基于NIST标准品验证），确保实验结果可靠性。

3. 便捷性与兼容性

• 即用型配方：无需额外添加MgCl?、dNTPs或染料，简化实验流程。

• ROX校正选项：部分型号预混ROX染料，适用于需要ROX校正的仪器（如ABI 7500 Fast）。

三、操作指南

（一）实验前准备

1. 试剂与耗材

• qBiomarker SYBR Fluor Mastermix（货号337839）

• 引物（终浓度100-900 nM，建议使用QIAGEN OligoPerfect Primer Design工具设计）

• cDNA模板（1-100 ng/反应，根据目标基因丰度调整）

• 无核酸酶水（Nuclease-Free Water）

• 八联管或96孔板（建议使用白色不透明板以减少荧光信号损失）

2. 仪器设置

• 预变性：95℃ 5分钟

• 40个循环：95℃ 10秒 → 60℃ 30秒（退火温度根据引物Tm值调整）

• 熔解曲线分析：60℃→95℃，每0.5℃采集一次荧光信号

• 温度程序：

• 荧光通道：选择SYBR Green通道（如ABI仪器为FAM/SYBR通道）。

（二）实验操作

1. 反应体系配制（以20 μL体系为例）：

   
   

   成分	体积（μL）
   qBiomarker Mastermix	10
   正向引物（10 μM）	0.4
   反向引物（10 μM）	0.4
   cDNA模板	2
   无核酸酶水	7.2

   
   

2. 加样与离心

• 使用多通道移液器加样，避免气泡产生。

• 离心（2000 × g，1分钟）确保液体沉至管底。

3. 上机运行

• 将八联管或96孔板放入qPCR仪，运行预设程序。

• 实时监测荧光信号，保存原始数据（Ct值、熔解曲线）。

（三）数据分析

1. Ct值判断

• 推荐Ct值范围：15-30（Ct>35需验证扩增特异性）。

• 阴性对照（NTC）Ct值应无扩增（Ct>40或未检测到）。

2. 熔解曲线分析

• 单一峰型（Tm值±0.5℃）表明特异性扩增。

• 多峰或肩峰提示引物二聚体或非特异性扩增，需优化引物或反应条件。

3. 定量方法

• 绝对定量：使用标准曲线法，构建已知浓度模板的Ct值与拷贝数关系。

• 相对定量：采用2?ΔΔCt法，以内参基因（如GAPDH）归一化。

四、使用技巧与高效操作

1. 引物优化

• 使用QIAGEN OligoAnalyzer工具评估引物二聚体形成风险。

• 梯度PCR确定最佳退火温度（Tm±5℃）。

2. 模板质量控制

• 使用Nanodrop检测RNA纯度（OD260/280 1.9-2.1，OD260/230 >2.0）。

• 琼脂糖凝胶电泳确认RNA完整性（真核生物应可见28S、18S、5S三条带）。

3. 仪器校准

• 定期使用NIST标准品验证仪器荧光检测准确性。

• 确保ROX校正功能正常（如适用）。

五、注意事项

1. 安全规范

• 避免反复冻融，分装后保存。

• 操作时佩戴手套，避免交叉污染。

2. 操作细节

• 移液精度：使用校准后的移液器，误差<±1%。

• 加样顺序：先加Mastermix，再加引物和模板，最后加无核酸酶水。

3. 故障排除

• 无扩增信号：检查引物质量、模板浓度及反转录效率。

• Ct值偏大：优化退火温度、延长延伸时间或提高模板投入量。

六、用户评价与支持

• 用户反馈：

• “qBiomarker Mastermix显著降低了Ct值，提高了低丰度基因的检测灵敏度。"

• “熔解曲线分析功能帮助我们快速识别非特异性扩增，优化了实验条件。"