PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶用户指南

PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶用户指南

——高性能Taq酶助力高通量PCR与基因组研究

一、产品概述

PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶 是KAPA Biosystems（罗氏诊断旗下品牌）研发的高性能Taq DNA聚合酶，专为高通量PCR、长片段扩增及二代测序（NGS）文库制备设计。该酶通过直接分子进化平台优化，具备超高保真性、抗抑制剂能力及扩增长片段DNA的优势，适用于复杂模板的扩增与基因组学研究。

核心参数：

• 货号：PKR2016

• 规格：100 units/支（可满足50次50 μL反应）

• 保存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融

• 有效期：24个月（未开封）

• 适用领域：医疗卫生、生物制药、农业育种、合成生物学等

二、技术优势

1. 超高保真性

• 错误率：2.8×10??（通过大规模二代测序验证），显著低于野生型Taq酶（1×10??）。

• 应用场景：适合SNP分型、基因编辑靶点验证、突变检测等对保真性要求高的实验。

2. 抗抑制剂能力

• 耐受性：可耐受血液、土壤、粪便等样本中的PCR抑制剂（如腐殖酸、血红素、肝素）。

• 优势：无需复杂样本预处理，直接用于临床样本、环境样本的扩增。

3. 扩增长片段DNA

• 最大扩增长度：基因组DNA可达15 kb，质粒DNA或噬菌体DNA可达18 kb。

• 应用场景：全长cDNA合成、BAC克隆扩增、长片段测序文库制备。

4. 高通量适配性

• 反应速度：扩增速度较传统Taq酶提升30%，适用于96孔板、384孔板自动化操作。

• 灵敏度：可检测低至1个拷贝的模板DNA，适用于稀有样本分析。

三、操作指南

（一）实验前准备

1. 试剂与耗材

• PKR2016 KAPA第二代基因工程酶（货号PKR2016）

• 引物（终浓度100-900 nM）

• DNA模板（1 ng–1 μg，根据目标片段长度调整）

• PCR缓冲液（含Mg2?，无需额外添加）

• 无核酸酶水

2. 仪器设置

• 预变性：95℃ 3分钟

• 30-40个循环：95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分钟/kb

• 终延伸：72℃ 5分钟

• 温度程序：

• 荧光通道：若结合荧光探针（如FAM、HEX），需选择兼容的qPCR仪。

（二）实验操作

1. 反应体系配制（以50 μL体系为例）：

   
   

   成分	体积（μL）
   PKR2016酶（2 U/μL）	0.5
   10×缓冲液	5
   dNTPs（2.5 mM）	4
   正向引物（10 μM）	1
   反向引物（10 μM）	1
   DNA模板	1-100 ng
   无核酸酶水	补足至50

   
   

2. 加样与离心

• 使用单通道或多通道移液器加样，避免气泡。

• 离心（2000 × g，1分钟）确保液体沉至管底。

3. PCR程序

• 预变性：95℃ 3分钟

• 循环：30-40个循环（95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分钟/kb）

• 终延伸：72℃ 5分钟

（三）NGS文库制备优化

1. 文库扩增：

• 使用PKR2016替代传统酶，可提高文库复杂度与覆盖均一性。

• 推荐反应体系：25 μL（含10 ng文库模板）。

2. 质量控制：

• 通过Qubit或Agilent Bioanalyzer检测文库浓度与片段分布。

（四）数据分析

1. 扩增效率验证

• 标准曲线法：计算斜率（-3.32±0.1）确认反应效率（90%-110%）。

• 熔解曲线分析：单一峰型表明特异性扩增。

2. 长片段扩增验证

• 使用λ噬菌体DNA（48.5 kb）测试扩增能力，目标片段长度≥15 kb。

三、使用技巧与高效操作

1. 模板预处理

• 对高GC含量模板（>65%）使用DMSO（5%-10%）或甜菜碱（1-2 M）辅助扩增。

• 对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，建议使用KAPA FFPE DNA修复试剂盒预处理。

2. 引物设计

• 引物长度18-25 bp，Tm值58-62℃。

• 避免二级结构与引物二聚体（使用Primer-BLAST或OligoAnalyzer评估）。

3. 反应条件优化

• 延伸时间：根据目标片段长度调整（1 kb/分钟）。

• 退火温度：通过梯度PCR确定最佳Tm值（±5℃）。

四、注意事项

1. 安全规范

• 避免反复冻融，分装后保存于-20℃。

• 操作时佩戴手套，避免RNA酶污染。

2. 操作细节

• 移液精度：使用校准后的移液器，误差<±1%。

• 加样顺序：先加缓冲液与酶，再加引物和模板，最后加dNTPs与水。

3. 故障排除

• 无扩增信号：检查引物质量、模板浓度及反转录效率。

• 非特异性扩增：提高退火温度或缩短延伸时间。

五、用户评价与支持

• 用户反馈：

• “PKR2016显著提高了长片段PCR的成功率，扩增效率优于竞品。"

• “在FFPE样本中，该酶的抗抑制剂能力显著减少了优化步骤。"