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樣本前處理：樣本固定宜采用 4% 多聚甲醛（PFA），且固定時(shí)間應(yīng)控制在 24 小時(shí)以內(nèi)，避免過度固定導(dǎo)致抗原表位被掩蔽，影響抗體與抗原的結(jié)合 。對(duì)于需要脫鈣處理的樣本，應(yīng)避免使用酸性脫鈣劑，推薦采用乙二胺四乙酸（EDTA）進(jìn)行脫鈣，保留抗原活性 。
實(shí)驗(yàn)流程：首先進(jìn)行抗原修復(fù)，使用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0），在 95℃條件下處理 20 分鐘，以恢復(fù)被固定過程掩蓋的抗原表位 。隨后用含有 5% 驢血清和 0.3% Triton X - 100 的封閉液在室溫下封閉 1 小時(shí)，減少非特異性背景染色 。一抗孵育時(shí)，將 SMC - 401 按 1:1000 的比例稀釋，在 4℃條件下孵育過夜，確?？贵w與抗原充分結(jié)合 。最后采用 HRP 標(biāo)記的二抗結(jié)合目標(biāo)抗體，并使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行顯色，注意避免使用金屬增強(qiáng)劑，防止背景染色加深 。預(yù)期結(jié)果在人腦 Lewy 小體染色中，陽性信號(hào)呈現(xiàn)為棕褐色顆粒狀沉積，在 40 倍顯微鏡下清晰可見，而白質(zhì)區(qū)域應(yīng)無染色，以此作為背景控制 。
樣本制備：確保樣本蛋白提取充分且保持完整性，可采用合適的細(xì)胞或組織裂解液進(jìn)行處理，并通過離心等手段去除雜質(zhì) 。
實(shí)驗(yàn)條件：使用 12% Tris - Glycine 凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至 0.2μm 的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為 100V 恒壓 60 分鐘 。轉(zhuǎn)膜后，用含有 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 Tris 緩沖鹽水吐溫（TBST）溶液封閉膜 1 - 2 小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合 。將 SMC - 401 抗體按 1:1000 的比例稀釋于封閉液中，4℃孵育過夜 。之后用 TBST 充分洗滌膜，再與 HRP 標(biāo)記的二抗孵育，最后通過化學(xué)發(fā)光法或顯色法檢測(cè)目標(biāo)條帶 。預(yù)期在大鼠腦膜裂解物的 WB 分析中，能夠清晰檢測(cè)到約 50kDa 的 SLC38A1 蛋白條帶 。
樣本準(zhǔn)備：收集適量細(xì)胞或組織樣本，裂解后獲取含有目標(biāo)蛋白的細(xì)胞裂解液，并通過預(yù)清除步驟去除可能與抗體非特異性結(jié)合的雜質(zhì) 。
實(shí)驗(yàn)操作：將 SMC - 401 抗體與 Protein A/G 磁珠或瓊脂糖珠進(jìn)行偶聯(lián)，形成抗體 - 磁珠復(fù)合物 。將復(fù)合物加入細(xì)胞裂解液中，4℃緩慢搖晃孵育數(shù)小時(shí)，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合 。通過磁力架或離心等方式分離磁珠或瓊脂糖珠，將結(jié)合有目標(biāo)蛋白及相關(guān)相互作用蛋白的復(fù)合物洗脫下來，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)鑒定和分析，如質(zhì)譜分析等，以深入研究與 SNAT1 相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò) 。
樣本固定與處理：嚴(yán)格控制樣本固定時(shí)間和條件，避免過度固定或固定不足 。對(duì)于不同類型的樣本，應(yīng)根據(jù)其特性選擇合適的固定劑和處理方法 。在樣本處理過程中，要防止蛋白降解，可在裂解液中添加蛋白酶抑制劑 。
抗體保存與使用：SMC - 401 抗體應(yīng)按照產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行保存，一般需在 - 20℃條件下儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融，以免影響抗體活性 。在使用前，應(yīng)將抗體從冰箱取出，在室溫下緩慢復(fù)溫，并輕輕混勻，避免劇烈振蕩 。
實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化：不同的實(shí)驗(yàn)樣本和實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡苄枰獙?duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，如抗體稀釋比例、孵育時(shí)間和溫度等 。建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件 。
非特異性染色：若在 IHC 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)全片非特異性染色，可能是抗原修復(fù)過度所致，可嘗試將抗原修復(fù)時(shí)間縮短至 10 分鐘 。此外，封閉不充分、二抗?jié)舛冗^高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)也可能導(dǎo)致非特異性染色，應(yīng)逐一排查并調(diào)整相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件 。
無目標(biāo)條帶（WB）：在 WB 實(shí)驗(yàn)中若未檢測(cè)到目標(biāo)條帶，可能是樣本中目標(biāo)蛋白含量過低，可嘗試增加上樣量或濃縮樣本 。另外，磷酸酶未被抑制可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白去磷酸化，影響抗體識(shí)別，可在樣本處理過程中添加 PhosSTOP 抑制劑 。
染色不完整（IHC）：如果在 IHC 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)斑塊染色不完整的情況，可能是組織脫水不充分，可適當(dāng)延長(zhǎng)梯度乙醇脫水時(shí)間，確保組織充分脫水，以利于抗體更好地滲透和結(jié)合 。
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