使用高容量cDNA逆转录试剂盒进行基因表达分析的实验步骤

样本收集与保存：根据实验目的收集合适的生物样本，如细胞、组织或体液等。收集后，立即将样本置于 RNA ?；ぜ林?，或液氮速冻后转移至 - 80°C 冰箱保存，防止 RNA 降解。

RNA 提取：使用合适的 RNA 提取试剂盒，如 TRIzol 试剂、硅胶膜柱式提取试剂盒等，按照说明书操作从样本中提取总 RNA。提取过程中注意避免 RNA 酶污染，使用无 RNA 酶的耗材和试剂，操作在冰上进行以减少 RNA 降解。

RNA 质量检测：通过分光光度计测定 RNA 浓度和纯度，A260/A280 比值应在 1.8 - 2.0 之间，A260/A230 比值应大于 2.0，比值偏离范围表明可能存在蛋白质、酚类或盐类污染。同时，进行琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，观察 28S 和 18S rRNA 条带是否清晰、亮度比例是否约为 2:1，若条带弥散则提示 RNA 降解。

试剂准备：从低温冰箱取出高容量 cDNA 逆转录试剂盒，置于冰上解冻。准备无 RNA 酶的 PCR 管、移液枪及枪头。

反应体系配制：在 PCR 管中依次加入以下试剂（以 20μl 反应体系为例）：2μg 总 RNA、1μl 随机引物或 1μl oligo (dT) 引物（根据样本类型选择）、4μl 5×RT Buffer、1μl 10mM dNTP Mix、1μl RNase Inhibitor、1μl Reverse Transcriptase，最后用无 RNA 酶水补足至 20μl。轻轻混匀，短暂离心使反应成分集中于管底。

逆转录反应程序：将 PCR 管放入 PCR 仪，设置反应程序：25°C 孵育 10 分钟（引物退火）；37°C 孵育 120 分钟（逆转录反应）；70°C 孵育 15 分钟（酶失活）。反应结束后，cDNA 产物可立即用于后续实验，或保存于 - 20°C 备用。

引物设计：根据目的基因序列，使用专业引物设计软件（如 Primer Premier、NCBI Primer - BLAST）设计特异性引物，引物长度一般为 18 - 25bp，Tm 值在 58 - 62°C 之间，GC 含量 40 - 60%。同时设计内参基因（如 β - actin、GAPDH）引物，用于数据归一化。

反应体系配制：在 PCR 管中依次加入：10μl 2×qPCR Master Mix、0.5μl 上游引物（10μM）、0.5μl 下游引物（10μM）、1μl cDNA 模板，用无 RNase 水补足至 20μl。轻轻混匀，短暂离心。

qPCR 反应程序：将 PCR 管放入实时荧光定量 PCR 仪，设置反应程序：95°C 预变性 3 分钟；95°C 变性 15 秒，60°C 退火 / 延伸 30 秒，共 40 个循环。反应结束后，分析扩增曲线和熔解曲线，确保扩增特异性。

数据分析：采用 2-ΔΔCt 法计算目的基因相对表达量。首先计算每个样本目的基因与内参基因 Ct 值的差值（ΔCt），再计算实验组与对照组 ΔCt 的差值（ΔΔCt），最后根据公式 2-ΔΔCt 得出目的基因相对表达倍数。

实时荧光定量 PCR（qPCR）：

基因芯片分析：将逆转录合成的 cDNA 进行标记（如采用荧光染料标记），标记后的 cDNA 与基因芯片上的探针进行杂交，经过洗涤、扫描等步骤，获取基因芯片图像。使用专业软件分析图像数据，得到每个基因的荧光信号强度，通过标准化处理后，分析基因表达差异，筛选出上调或下调基因。

转录组测序（RNA - seq）：将 cDNA 构建测序文库，利用高通量测序技术进行测序。测序数据经过质量控制、比对到参考基因组或转录组、定量分析等步骤，得到基因表达谱。通过差异表达分析、富集分析等生物信息学方法，深入研究基因表达变化及其功能意义 。