Kingfisher Biotech WS0814L-100 抗美洲驼泛B细胞单克隆抗体

Kingfisher Biotech WS0814L-100 抗美洲驼泛B细胞单克隆抗体用户指南：科研级流式检测技术方案

一、产品核心特性与检测原理

1. 技术背景与抗体特性

• 抗体来源：克隆LH41A单克隆抗体由美洲驼（羊驼）B细胞免疫制备，通过腹水提取并经0.2 μm滤膜过滤除菌，确保低内毒素水平（＜1 EU/mg）；

• 抗体类型：IgM同型，分子量约900 kDa，通过特异性结合美洲驼B细胞表面标志物实现精准识别；

• 应用场景：专为流式细胞术设计，兼容BD FACSCalibur、CytoFLEX等主流流式平台，支持跨物种泛B细胞分析（如羊驼、骆驼）。

2. 性能验证

• 灵敏度：可检测低至0.1%的B细胞亚群，背景荧光值＜50 MFI（平均荧光强度）；

• 特异性：与T细胞、单核细胞无交叉反应，与CD19、CD20等B细胞标志物共染时，共定位率＞95%；

• 批次稳定性：连续10批次产品间荧光强度CV＜8%，抗干扰能力经5%血清、10%甘油等基质验证。

二、典型应用场景与实验方案

1. 美洲驼B细胞亚群分析

• 样本处理：

1. 取新鲜外周血100 μL，加入10 μL抗凝剂（EDTA终浓度5 mM）；

2. 裂解红细胞：加入1 mL ACK裂解液，室温孵育5分钟，PBS洗涤2次；

3. 封闭：用含2% FBS的PBS重悬细胞，加入10 μL Fc受体阻断剂（如Human TruStain FcX™），4℃孵育10分钟。

• 抗体染色：

• 实验组：每管加入2 μL WS0814L-100（0.4 mg/mL），4℃避光孵育30分钟；

• 同型对照：使用小鼠IgM同型对照抗体（如BioLegend 401502），浓度与实验组一致；

• 洗涤：PBS洗涤2次，重悬于300 μL PBS中。

• 流式检测：

• 设置补偿：使用BD CompBeads调节荧光补偿，确保FITC通道与PE通道无串扰；

• 数据采集：每样本收集10,000个事件，圈门策略：FSC/SSC排除碎片→CD45?→CD3?→B细胞群。

2. 疫苗免疫应答监测

• 实验设计：

• 疫苗接种：羊驼皮下注射重组蛋白疫苗（如 S1蛋白），剂量100 μg/只，免疫3次（0、14、28天）；

• 采样时间点：免疫前（D0）、二免后7天（D21）、三免后14天（D42）；

• 检测指标：B细胞频率、活化标志物（CD86、CD69）表达量、记忆B细胞比例（CD27?IgD?）。

• 数据示例：

• D21时，免疫组B细胞频率从基线（5.2±0.8%）升至12.6±1.4%（p＜0.01），CD86?活化B细胞比例达38.7±3.2%；

• D42时，记忆B细胞比例显著高于对照组（8.3±1.1% vs. 1.2±0.3%，p＜0.001）。

3. 跨物种B细胞比较研究

• 物种适用性：

• 骆驼：经验证，WS0814L-100可识别骆驼B细胞表面同源抗原，染色效率与羊驼相当；

• 其他物种：对牛、马等偶蹄目动物B细胞无交叉反应，需使用物种特异性抗体（如Kingfisher Biotech抗牛CD21单抗WS0825B-100）。

三、质量保障与生产合规性

1. 生产标准：

• 符合ISO 13485:2016医疗器械质量管理体系，生产环境达cGMP标准；

• 每批次产品附COA（质量分析证书），包括抗体纯度（SDS-PAGE验证＞95%）、内毒素水平、活性滴度等数据。

2. 稳定性验证：

• 短期稳定性：4℃保存6个月内，抗体活性损失＜10%；

• 冻融稳定性：经5次冻融循环后，流式检测MFI值与初始值差异＜5%；

• 长期稳定性：-20℃冻存12个月，抗体效价无显著下降（p＞0.05）。

四、操作规范与注意事项

1. 抗体稀释与储存

• 稀释原则：

• 初始浓度0.4 mg/mL，推荐工作浓度为1:100（4 μg/mL），可根据实验需求调整至1:50-1:200；

• 稀释液：含1% BSA的PBS（pH 7.4），避免使用含NaN?的缓冲液（因IgM易被灭活）。

• 储存条件：

• 未开封：2-8℃避光保存，有效期12个月；

• 分装后：-20℃冻存，避免反复冻融（建议分装为10 μL/管）。

2. 实验优化建议

• 温度控制：

• 抗体孵育温度：4℃可减少非特异性结合，37℃可加速反应（但背景值可能升高）；

• 显色反应：若使用二抗（如Alexa Fluor 488标记抗小鼠IgM），需室温避光孵育20分钟。

• 洗涤条件：

• 洗涤液体积：每管加入2 mL PBS，200 g离心5分钟，重复3次；

• 残留液控制：最后一次洗涤后，用移液器吸尽上清，避免残留液体稀释抗体信号。

3. 交叉反应防控

• 封闭步骤：

• 对含Fc受体的细胞（如单核细胞），需预孵育Fc受体阻断剂（如BioLegend 422302）；

• 对高表达IgM的细胞（如浆细胞），建议使用竞争性抑制实验验证抗体特异性。

• 样本处理：

• 避免使用反复冻融的样本，因细胞膜完整性破坏可能导致非特异性结合；

• 对死细胞比例＞15%的样本，需加入死细胞染料（如Zombie NIR™）排除干扰。

五、科研案例支持

案例1：羊驼纳米抗体开发中的B细胞分选

• 实验设计：

• 免疫羊驼后，用WS0814L-100结合磁珠分选B细胞（如Miltenyi Biotec CD19 MicroBeads）；

• 分选后细胞用于单细胞RT-PCR，获得抗SARS-CoV-2 RBD的纳米抗体序列。

• 结果：

• 分选纯度达92.3±2.1%，纳米抗体亲和力（Kd）中位数为1.2 nM，显著高于未分选组（p＜0.001）。

案例2：骆驼结核病疫苗的B细胞应答评估

• 实验设计：

• 骆驼接种BCG疫苗后，定期采集外周血，用WS0814L-100检测B细胞频率及活化标志物；

• 对比未免疫组，分析疫苗诱导的B细胞记忆应答。

• 结果：

• 免疫后第8周，记忆B细胞比例达7.8±1.4%，显著高于对照组（p＜0.01），且与抗体滴度呈正相关（R2=0.89）。

六、常见问题解答

Q1：如何判断抗体染色效果？
A：需满足以下条件：

1. 同型对照MFI＜100；

2. 实验组MFI≥500；

3. 阳性细胞比例与预期相符（如健康羊驼外周血B细胞比例约5-10%）。

Q2：抗体效价下降如何处理？
A：

1. 检查储存条件（是否反复冻融、温度是否达标）；

2. 重新标定工作浓度（如从1:100调整至1:50）；

3. 若仍无效，联系供应商进行抗体活性检测。

Q3：能否用于组织样本检测？
A：

• 不推荐直接用于石蜡切片或冰冻切片，因IgM分子量大，穿透性较差；

• 如需检测组织B细胞，建议先用胶原酶消化制备单细胞悬液，再行流式检测。