FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit 用户指南

FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit 用户指南

——高效、低样本量DNA文库构建解决方案

一、产品概述

FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit（货号：FC-121-4003）是一款专为Illumina高通量测序平台设计的DNA文库构建试剂盒，适用于低起始量DNA样本（100 ng）的高效建库。该试剂盒基于磁珠纯化技术，通过优化PCR扩增和片段选择流程，显著降低文库偏差（bias）和覆盖度缺口（coverage gaps），为全基因组重测序、靶向测序及表观遗传学研究提供高质量数据支持。

核心参数：

• 规格：96样本/板（96 indexes in plate format）

• 适用样本类型：基因组DNA（gDNA）

• 起始量：100 ng（350 bp插入片段）或200 ng（550 bp插入片段）

• 文库构建时间：<1天（手动操作）

• 兼容读长：2×101 bp至2×151 bp

• 储存条件：-15℃至-25℃避光保存

二、技术优势

1. 低样本量兼容性

• 微量DNA输入：仅需100 ng起始量，适用于肿瘤组织、FFPE样本等珍贵样本的建库。

• 样本?；?/span>：减少DNA消耗，保留样本用于后续分析。

2. 高覆盖度与低偏差

• 磁珠纯化替代凝胶回收：避免传统凝胶电泳导致的样本损失，提升回收率。

• 优化PCR扩增：减少PCR诱导的覆盖度缺口，GC富集区、启动子及重复序列的覆盖度显著提升。

3. 高通量支持

• 96样本并行处理：96孔板格式设计，适配自动化平台（如Biomek i7），单次运行可处理96个样本。

• 灵活索引配置：提供96种索引，避免样本混淆。

4. 快速工作流程

• 简化操作：预混试剂减少移液步骤，降低操作误差。

• 单日建库：从DNA片段化到文库富集，全流程可在1天内完成。

三、操作指南

（一）实验前准备

1. 试剂与耗材

• FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit

• 96孔PCR板、磁力架、移液器（10-1000 μL）、Qubit荧光定量仪

• 超声波打断仪（如Covaris）、AMPure XP磁珠

2. 样本准备

• DNA质量评估：使用Qubit或PicoGreen定量，A260/A280比值≥1.8。

• 片段化：将DNA片段化至350 bp或550 bp（推荐Covaris超声波打断）。

（二）实验操作

1. 末端修复与加A尾

• 将片段化DNA与末端修复酶混合，37℃孵育30分钟，72℃孵育30分钟。

• 加入dATP和Taq酶，72℃孵育30分钟，完成加A尾。

2. 接头连接

• 添加预混的接头（Adapters）和连接酶，20℃孵育15分钟。

3. 磁珠纯化

• 使用AMPure XP磁珠回收连接产物，去除未结合的接头。

4. PCR扩增

• 98℃ 30秒

• 98℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 30秒（循环数：8-12）

• 72℃ 5分钟

• 配置PCR反应体系（含Index Primer），按以下程序扩增：

5. 文库富集与质量控制

• 再次使用磁珠纯化PCR产物，Qubit定量并使用Agilent Bioanalyzer或TapeStation检测片段分布。

（三）实验后处理

• 文库混合：将等量文库混合后，使用KAPA Library Quantification Kit定量。

• 上机测序：稀释至4 nM，与PhiX质控DNA混合后上机（建议比例：5% PhiX）。

四、使用技巧与高效操作

1. 优化DNA片段化

• 片段大?。?50 bp（Duty Factor 10%，Peak Incident Power 175，Cycles/Burst 200，Time 60秒）

• 片段大?。?50 bp（Duty Factor 10%，Peak Incident Power 175，Cycles/Burst 200，Time 120秒）

• 使用Covaris ME220超声波打断仪，参数建议：

2. 提高文库质量

• 磁珠纯化时，确保DNA与磁珠比例（推荐1:0.8），避免过度清洗导致DNA损失。

• PCR循环数根据起始量调整（100 ng DNA建议10-12个循环）。

3. 质量控制要点

• Qubit定量：确保文库浓度≥2 nM。

• Bioanalyzer分析：主峰应在目标片段大小±20 bp范围内，无接头二聚体峰。

五、注意事项

1. 安全规范

• 操作时佩戴手套与护目镜，避免试剂接触皮肤或吸入。

• 废弃物需按化学危险品处理。

2. 操作细节

• 移液精度：使用校准后的移液器，误差<±1%。

• 温度控制：确保试剂和文库在规定温度下储存和处理。

3. 故障排除

• 文库浓度低：检查PCR循环数是否过低或磁珠纯化效率。

• 片段分布异常：调整片段化参数或延长磁珠纯化时间。

六、用户评价与支持

• 用户反馈：

• “FC-121-4003试剂盒显著降低了FFPE样本的建库失败率，数据质量稳定。"

• “磁珠纯化流程简单高效，适合高通量样本处理。"